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如何用MTT法检测细胞增殖?

阅读次数:380发布时间:2021/1/20 11:07:15

一、实验方法原理
MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂,生成蓝色的 formazan 结晶,formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将 MTT 还原)。还原生成的 formazan 结晶可在含 50% 的 N,N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的 MTT 溶解液中溶解,利用酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值,以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。

二、实验材料
1.细胞样品
2.试剂、试剂盒:10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO
3.仪器、耗材:96 孔板 离心机 酶联免疫监测仪

三、实验步骤
1.接种细胞
用含 10% 胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔 1000-10000 个细胞接种到 96 孔板,每孔体积 200ul。

2.培养细胞
同一般培养条件,培养 3-5 天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3.呈色
培养 3-5 天后,每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 配)20ul. 继续孵育 4 小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO,振荡 10 分钟,使结晶物充分融解。

4.比色
选择 490nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
 

原创作者:上海劲马实验设备有限公司

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