酶联免疫吸咐试验（ELISA）具有灵敏度高、特异性好的特点，广泛应用于各种传染性疾病的筛查，如肝炎、HIV，也可应用优生优育等。的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA实验结果准确、可靠的必要条件。试验中若不做好相关控制，易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各级研究实验室常遇到的问题。现将ELISA实验操作中的影响因素总结如下： 

　　1标本因素 

　　以辣根过氧化物酶（HRP）为标记的ELISA测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，在研究试验中，有时为了争取时间而快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 

　　因此血清标本宜在新鲜时检测，禁用严重溶血的标本。一般说来，在5 d内测定的血清标本可放置于2～8℃，标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。超过1周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测，宜少量分装冰存；使用一次性玻璃试管或真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷，能吸附酶标记物，不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶或一次性真空促凝采血管。 

　　2试剂因素 

　　ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒。因此，有些厂家为了保持较好的本底而采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗菌素原。第三代试剂的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下： 

　　基因工程抗原是抗菌素原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点。①分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗菌素原，分子量更大。②稳定性好。包被抗原的稳定性决定试剂盒的有效期，早期以合成肽为包装抗原的试剂盒有效期只有3～4个月，改作基因工程抗原后有效期大大延长了。③基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。④纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：分子量太小；一般只含有一个抗原决定簇；纯度高；稳定性差。 

　　国内酶联免疫试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%，99.3%，78%，89%，存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用劣质的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 

　　选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差异小、操作方便、省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期评估结果，可作为选择试剂的主要依据； 要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为1年。选择刚出厂的试剂使用；不同厂家的试剂不能混用。 

不同方法学的检测试剂会使乙肝两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中，常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外，还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的区别。

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原创作者：上海劲马实验设备有限公司