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真核转染的实验步骤

阅读次数：754发布时间：2013/8/2 9:26:07

一、试剂准备
1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。
2、核酸贮存液，过滤除菌。
3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。
二、操作步骤
（一）克隆目的基因
1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。
2、回收特异性扩增片段，连入T载体。
3、转化DH5α，质粒制备。
4、酶切初步鉴定，测序证实。
（二）真核重组表达载体的构建：
    pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。
   重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切
   回收插入片段和pcDNA3线性片段
   T4连接酶连接
   转化DH5α
   质粒制备
   BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。
（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：
1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。
2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。
3、   SHG-44细胞的转染：
(1)   转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。
(2)   准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg 到总体积50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。
(3)   不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。
(4)   37℃孵育6hr。
(5)   6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。
(6)   转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。
4、   G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。
（一）筛选结果鉴定：
（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因
（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。
（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响
    ①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G₁期和G₂/M、S期比例。
    ②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×10⁴/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
    ③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→10⁴细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
   脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
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原创作者：上海劲马实验设备有限公司

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