在ELISA试剂盒操作中，大家普遍都会认为ELISA实验的原理很简单，固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会影响您对结果的判断。
一、洗涤很重要
洗涤步骤看似多余，实则很重要，因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音；如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应；如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。
二、封闭更关键
封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。如果背景过高，怀疑封闭不充分，那么可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么该花些时间来优化封闭液。
目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、抗体和检测试剂，好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。
ELISA试剂盒zui常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%)，它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。
蛋白封闭液则有所不同，它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子，常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶，血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用，但它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用，解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。
三、抗体浓度须优化
试剂不同，则需要优化抗体的量，非特异的抗体结合会增加背景，为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。
四、检测试剂要适量
切勿使用过多的检测试剂，如果浓度过高，或者未正确稀释，则会导致高背景，也不要显色过度。如果您的ELISA试剂盒操作中不幸地遇到了高背景，那么也无需太担心，依次查看ELISA系统中的组分，并排除可能存在的问题。悉心优化，很快就会有漂亮的结果。
原创作者：上海劲马实验设备有限公司
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