FITC荧光素标记抗体的方法与操作步骤
上海劲马生物科技有限公司介绍标记荧光抗体的方法,如：Marsshall法、Chadwick法、透析标记法等,并具体讲解各种方法所需材料和操作步骤.
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物.一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般最多能结合15～20个,一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC,其反应式如下：
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法.
1.Marsshall法
(1)材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol／L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／LPBS等.
(2)方法及步骤
①抗体的准备：取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min.
②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末.也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量,还可以算出需加缓冲液的量.
a.蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml.
b.总蛋白量(AXB)＝Crag.
c.C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml,用C／10；如高于20mg／ml,用C／20).
d.荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg.
e.巳0.5mol／L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml.
f. PBS量D-(B+F)=Gml.
注：A为蛋白含量,mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量,mg；D为常数,mg；正为荧光素的量,mg；F为碳酸盐缓冲液的容积,ml；G为PBS的容积,ml.
③结合(或标记)：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完),加完后,继续避光搅拌12h左右.结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中.
④透析：结合完毕后,将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中,再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜.
⑤过柱：取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定.洗脱液：0.01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1.7倍左右).
2.Chadwick法
(1)试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管,无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等.
(2)方法及步骤
①抗体准备：用o～4~C的pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml,置入25ml烧杯内,放于冰槽中.
②荧光色素准备：按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算,称取所需的荧光素,用3％碳酸钠水溶液溶解.
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅匀,在o～4~C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h.
④透析和柱层析：方法同Marsshall法.
3.改良法
(1)试剂和材料
①0.01mol／L(pH7.2)PBS配法中,校定pH至7.2.NaCi 18g、Na2HP04 1.15g,溶于2000ml蒸馏水
②0.5mol／L(pH9.0)碳酸盐缓冲液配法 取0.5mol／LNazCOs(5.3％)10ml加入0.5mol／LNaHC03(4.2％)90ml,混合后,校定pH至9.0.
③3％碳酸钠水溶液配法 称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成.
④其他试剂和材料 l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等.
(2)方法及步骤
①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清,分离球蛋白,用盐水(0.15mol／LNaCl)及缓冲液(0.5mol／LNaHC03—Na2C03,pH9.0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg,缓冲液为总量的10％,降温至4℃.
②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg/mg],在0～4℃下电磁搅拌12～14h.
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离,除去未结合的荧光素,再用缓冲盐水透析,除去硫酸铵(用Nessler试剂测验,至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止).
④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o.01％,分装在lml安瓿中,或冻干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,一20℃保存可达2年以上.
4.透析标记法
此法适用于小量抗体的荧光素标记,标记简便,非特异性染色较少.
(1)试剂和材料：试剂和材料同改良法.
(2)方法及步骤
①用0.025mol／L碳酸盐缓冲液pH9.0,将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度,装入透析袋中.
②用同一缓冲液将FITC配成0.1mg／ml的溶液,按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍,将FITC稀释液盛于圆柱形容器内,并使透析袋浸没于FITC液中.
③容器顶端盖紧,底部放搅拌棒,在4~C电磁搅拌下透析标记24h.取出透析袋中标记液,即刻用SephadexG50凝胶过滤,去除游离荧光素,分装,贮存于4℃中.
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